Криоэлектронная микроскопия — что это за метод
Структуры молекул, полученные в последние годы, впечатляют. Здесь и целый «шприц» сальмонеллы, которым она атакует клетки, и белки, которые обеспечивают бактериям устойчивость к антибиотикам, и красивейшие структуры у основания жгутиков, и удивительно красивые ферменты. От фундаментальных биологических знаний о работе биомолекул в клетке, до понимания того, как ведут себя молекулы медицинских препаратов – все это мы можем получить благодаря методу криоэлектронной микроскопии, за развитие которого присудили Нобелевскую премию по химии в 2017 году.
Но что это за метод и почему без него нельзя было добиться тех же результатов? Ведь к тому времени существовала и рентгеновская кристаллография, и просто электронная микроскопия. Однако эти методы накладывали на исследователей несколько важных ограничений, за преодоление которых – или, если точнее, «за развитие методов криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворах с большим разрешением», и была сегодня присуждена престижная награда.
Получат ее в этом году трое ученых, стоявших у истоков этой технологии: француз Жак Дюбоше, который работает в Университете Лозанны, рожденный в Германии Иоахим Франк из Университета Колумбии в Нью-Йорке и шотландец Ричард Хендерсон из лаборатории молекулярной биологии в Кембридже (к слову, это, кажется, уже пятнадцатый лауреат из этой лаборатории). Но давайте обо всем по порядку.
Когда Эрнст Руска изобрел и продемонстрировал электронный микроскоп (за который он тоже получил свою Нобелевку в 1986), с помощью которого можно увидеть позиции отдельных атомов, другой ученый, Ладислав Мартон, написал статью о том, что новым методом трудно изучать биологический материал, ведь биомолекулы и клетки разрушаются под действием потока электронов. Этот поток должен был быть очень слабым, чтобы не повредить образцы, но такой слабый поток давал плохое разрешение. Для электронной микроскопии образец должен был быть тонким и плоским, что тоже усложняло задачу: приходилось достраивать 3D-модели изучаемых молекул (например, белков) из двухмерной проекции.
Естественно, об изучении живых клеток не могло быть и речи, а ведь в разрушенном состоянии они выглядят совсем не так, как во время работы. К тому же, электронному микроскопу нужен был вакуум, а в нем испарялась вся вода, которая помогает биомолекулам поддерживать их естественную форму. Все это было сложно и неудобно – до тех пор, пока не появилась криоэлектронная микроскопия.
Белок извивался, семь раз проходя сквозь мембрану
Ричард Хендерсон работал с белками в Кембридже, используя рентгеновскую кристаллографию – метод, с помощью которого Розалинд Франклин получила знаменитые изображения, на основе которых Уотсон и Крик построили модель двойной спирали ДНК. Все было хорошо, пока Хендерсон не занялся мембранными белками, находящимися в оболочке клетки. «Вынутые» из своей естественной среды, они превращались в бесполезную запутанную кучу атомов. Один из них Хендерсон не смог выделить в достаточных количествах, другой не удавалось кристаллизовать.
Но все изменилось, когда Хендерсон взялся за светочувствительный белок бактериородопсин. Ученый решил не вытаскивать его из мембраны, а поместил целый кусок мембраны под электронный микроскоп вместе с ним. Чтобы структура не разрушилась, ее покрыли раствором глюкозы. Чтобы не повредить образец мощным потоком электронов, ученые пустили более слабый луч.
Изображение, как и ожидалось, вышло не очень четким и контрастным, но тут они применили тот же математический метод, что и при рентгеновской кристаллографии, – это позволила сама структура белков, которые располагались в мембране ориентированными в одном и том же направлении. Картинки, полученные с разных углов зрения, показали, что белок извивается, семь раз проходя сквозь мембрану (теперь такие белки известны под названием семиспиральных рецепторов). Это было изображение лучшего качества из всех, когда-либо полученного с помощью электронного микроскопа.
Разрешение в семь ангстрем впечатлило многих, но Хендерсон не желал останавливаться: ему хотелось достичь такого же разрешения, как и при рентгеновской кристаллографии, в три ангстрема. Со временем стали лучше линзы, появились и технологии заморозки, позволяющие сохранить образец в жидком азоте. Для получения более четкого изображения бактериородопсина Хендерсон ездил по разным лабораториям, используя лучшие электронные микроскопы в мире. Все они имели те же недостатки, но дополняли друг друга.
И только в 1990 году, спустя 15 лет с получения первой, неказистой, на современный взгляд, картинки, Хендерсон достиг своей цели. Он показал, что криоэлектронная микроскопия может быть полезна для изучения биомолекул, однако его бактериородопсин был упорядочен и был практически зафиксирован в мембране клетки. Очень мало других белков могут похвастаться тем же, поэтому биологи посчитали, что это все же очень ограниченный метод.
Сочетание методов
В это самое время по другую сторону Атлантики, в Нью-Йорке, Йоахим Франк уже давно работал над решением этой проблемы. Уже в 1975 году он придумал теоретический подход, но на реализацию его ушло много лет. Его идеей было создать компьютер, который может отличать случайно расположенные белки от хаотичного «заднего плана». Он придумал математический метод, позволяющий компьютеру находить разные повторяющиеся последовательности в изображении. Компьютер сортировал паттерны, объединяя похожие, чтобы получить усредненное, но более резкое изображение. Франк опубликовал несколько работ с двухмерными моделями белков высокого разрешения с разных углов зрения. Алгоритмы были готовы к 1981 году.
Следующим шагом стало создание алгоритма, который найдет похожие 2D-картинки и сам соберет их в 3D-структуры. В середине восьмидесятых Франк опубликовал эту часть метода и взялся за грандиозное дело – построение модели поверхности рибосомы, гигантской молекулярной машины для сборки белка в клетке.
Еще чуть раньше, в 1978 году, другой ученый, Жак Дюбоше, занялся решением третьей части этой проблемы электронного микроскопа. Как мы помним, биомолекулы очень страдали, превращаясь в бесформенную массу, если испарялась вода вокруг них – а в вакуумной камере электронного микроскопа она обязательно испарялась. Простая заморозка не давала результатов: кристаллики льда, расширяясь по сравнению с водой, могли разорвать изучаемый белок и разрушить его структуру. Если Хендерсон повезло с бактериородопсином, то другие ученые мучались с немембранными белками, растворимыми в воде.
Дюбоше придумал сверхбыстрый способ заморозки с помощью жидкого азота – вода как бы «остекленевала», и поток электронов отлично отражался от нее и давал хорошее изображение. Это позволило отлично подготовить биологический материал к работе – что Дюбоше и доказал, опубликовав несколько структур вирусов, полученных этим способом, в 1984 году.
С этого момента исследователи начали обращаться к Дюбоше, чтобы научиться его методу. С ним встретился и Франк, который пришел к нему для получения структуры поверхности рибосомы. Сочетание методов Дюбоше, Франка и Хендерсона легло в основу криоэлектронной микроскопии.
Собственно говоря, именно необходимость получения структуры «живой» рибосомы и «двигала» желание поскорее освоить метод: рибосома – одна из основных мишеней действия антибиотиков, для которых очень важно пространственное совмещение с полостями рибосом. И сейчас большинство комплексов потенциальных антимикробных препаратов с рибосомами «смотрят» именно методами криоэлектронной микроскопии.
Метод стал настолько важен, что в мире проводится немало крупных конференций, посвященных именно методу CryoEM, как сокращенно называют метод в англоязычной литературе.